GENETİK KAVRAMLAR
____________________________________________________________________________________________________________________________________
BİO
304 MOLEKÜLER GENETİK LABORATUVAR
DENEY
LİSTESİ
1. DENEY : a) BAKTERİLERDE CANLI HÜCRE SAYIMI
b) E.coli DE YABAN TİP VE MUTATOR SUŞDA NALİDİKSİK ASİTE KARŞI
SPONTAN MUTASYON SIKLIĞININ ÖLÇÜMÜ
c) E.coli HÜCRELERİNE UV (ULTRAVİYOLE) IŞINI UYGULAMASI VE CANLI
KALAN HÜCRELERİN TESPİTİ
2. DENEY : a) BAKTERİLERDE (E.coli )OKSOTROFİK GEREKSİNİMLERİN ÇİZGİ TESTİ
METODUYLA MİNİMAL AGAR (MA) VASATINDA GÖZLENMESİ
b) E.coli'de KONJUGASYON
3. DENEY : a) KOLİSİN FAKTÖR VARLIĞININ GÖZLENMESİ
b) İNDİKATÖR VASAT OLARAK KULLANILAN EMB-LAKTOZ AGAR
PLAKLARINDA LAKTOZ POZİTİF (LAC+) VE LAKTOZ NEGATİF (LAC-)
E.coli SUŞLARININ GÖZLENMESİ
4- DENEY : a) SOĞAN’DAN DNA İZOLASYONU
b) DNA'NIN AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ
5- DENEY : SALMONELLA MİKROZOM (AMES) TEST SİSTEMİ İLE MUTAJENİK ETKİNİN
SAPTANMASI
1. DENEY
BAKTERİLERDE
CANLI HÜCRE SAYIMI
GİRİŞ
Bir bakteri kültüründeki canlı hücrelerin sayımı seyreltilmiş (dilüsyon) kültürden alınan belirli miktardaki örneğin, Nütrient agar vasatlarına ekimi ile gözlenir. Ekim yapılan örnekten belli inkübasyon süresi sonunda koloni oluşturan hücreler canlı hücreler olup, bunların sayımı ile kültürümüzdeki canlı hücrelerin sayısını belirleyebiliriz.
Burada önemli olan bir bakteri kültüründeki toplam hücre sayısı ile canlı hücre sayısı arasındaki farkı bilmektir. Bakteri kültüründeki toplam hücre sayımı Elektronik Koloni sayaçları, Thoma Camı ile mikroskopik sayım, Spektrometrik sayım vb. tekniklerle yapılabilir. Fakat bu metodlarla yapılan sayım sonucu elde edilen veri ya toplam hücre sayısının ya da hücre kütlesinin (cell mass) ortaya çıkmasını sağlar. Bu metodlarla elde edilen toplam hücre sayısı, canlı hücre sayısı demek değildir. Örneğin Thoma camı ile mikroskopta sayılan toplam bakteri hücrelerinden bir kısmı ölü olabilir. Gerçek anlamda canlı hücreler, Nütrient Agar vasatlarına yapılan ekim sonucunda gözlenen kolonilerdir. Genellikle bir Bakteri kültüründeki canlı hücre sayısının toplam hücre sayısına oranı sonunda bulunan rakam, ekim verimliliği olarak adlandırılır (Plaking efficiency). Genel ekim verimliliği oranı, zengin vasatlarda, Minimal vasata göre daha yüksektir.
ARAÇ VE GEREÇLER
A) Gecelik E. coli kültürleri (5 ml.) (KL398 ve KL398 mutH)
B) 9 ml salin içeren tüpler (Salin: % 0.9 NaCl olup seyreltme çözeltisidir.)
C) Cam baget ve pipetler
D) Alkol
E) Dezenfektan
İZLENECEK YOL
Masanızda bulunan tüplükteki 7 tüpün herbirinde 9 ml salin vardır. Gecelik Bakteri kültüründen 1 ml alarak birinci tüpün içinde iyice karıştırınız (pipetle birkaç çekme ve üfleme, veya voteksde tüpü titreşime tutarak). Bu durumda 1 nolu tüpteki bakteri kültürü, 1:10 = 10-1 kez seyreltilmiştir. Sonra 1 nolu tüpten alınan 1 ml örnek, 2 nolu tüp içinde iyice karıştırılır. İki nolu tüpteki seyreltme oranı 1 : 100 = 10-2 olmuştur. Bu işlemleri diğer tüpler içinde yapınız.
II nolu tüpten 1 ml alıp III nolu tüpe,
III " " 1 ml alıp IV " "
IV " " 1 ml alıp V " "
V " " 1 ml alıp VI " "
VI " " 1 ml alıp VII " " koyup iyice karıştırın. Birinci tüpten itibaren onluk seri seyreltmelerle gecelik kültürünü 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
I nolu petriye 0.1 ml 10-4 , II nolu petriye 0.1 ml 10-5 , III ve IV nolu petriye 0.1 ml 10-6
ve V ve VI nolu petrilere 10-7
seyreltmeden 0.1 ml pipetleyerek cam bagetle yayınız. yayılan kültürün kuruması için bir kaç dakika bekleyiniz. Sonra Nütrient agarlı petri kaplarını 37°C lık etüve koyunuz. Ertesi gün petri kaplarını etüvden alarak kolonileri sayıp, canlı hücre sayısını elde ediniz (30-300 arası koloni veren petri kaplarının sayımda kullanılması idealdir). Örneğin, 10-6 kez seyreltilmiş kültürden alınan 0.1 ml'lik örnek, ortalama 200 koloni oluşmasına neden olmuşsa, bizim orjinal kültürdeki canlı hücre sayımı 1 ml için= 200 x 106 x10= 2x109/ml (0.1 ml'den 200 koloni meydana gelmişse 1 ml 'den 200 x 10 = 2000 koloni meydana gelir).
5 ml'lik kültürdeki ortalama canlı hücre sayısı ise = 5 x 2 x 109 = 1x1010 dur.
I, II, III-IV ve V-VI nolu petri vasatlarında gözlediğiniz farklı üreme yoğunlukları için ne yorum yaparsınız?
Bu işlem hem KL398 hem de KL398 mutH suşları için yapılacaktır.
E.
coli 'DE, YABAN TİP ve MUTATOR SUŞDA
NALİDİKSİK ASİTE KARŞI SPONTAN MUTASYON SIKLIĞININ ÖLÇÜMÜ
Nalidiksik asit, E. coli'de DNA replikasyonu inhibitörü olup, bu antibiyotiğe karşı direnç kazanma, gyrA (nalA), gyrB (nalB) genlerindeki mutasyonlarla sağlanır. Bu genlerden gyrA, mutasyona uğramışsa suş yüksek dozda nalidiksik asite (100 µg/ml'ye kadar) karşı direnç kazanmıştır. İkinci gen gyrB olup, bu gendeki mutasyon suşda, düşük konsantrasyonda nalidiksik asite (4 µg/ml) karşı direnç kazanılmasını sağlar.
ARAÇ VE GEREÇLER
A) Canlı hücre sayımı deneyindeki malzemeler
B) Nalidiksik asitli Nütrient agarlar
İZLENECEK YOL
Masanızda; 50 µg/ml nalidiksik asit içeren nutrient agar vasatları vardır. Bu nalidiksik asitli vasatlara gecelik kültürlerin, her birinden 0.1 ml hücreyi cam bagetle yayarak ekiniz. Ekimden sonra petri kaplarındaki 37°C'lık etüve kaldırın. Bir gece inkübe edin. Ertesi gün petri kaplarındaki KL398 ve KL398 mutH suşlarının nalidiksik asite dirençli (rezistan, NalR) ve kolonilerini sayın.
MUTASYON SIKLIĞI
Canlı hücre sayımı deneyinde, size verilen kültürlerin sayımını yapmıştınız. Örneğin KL398 suşunun canlı hücre sayımı 1x109/ml olsun. 50 µg/ml nalidiksik asit içeren nutrient agar vasatında da 10 adet NalR koloni saydığınızı varsayın. Bu durumda 1 ml'deki bakteri kültürünün 50 µg/ml Nalidiksik asite karşı;
Mutasyon Sıklığı = NalR kolonilerin sayısı =
Canlı Hücre Sayısı
= 100 = 1x10-7 /ml
109
NOT: Mutasyon sıklığı 1 ml için hesaplandığından 0.1 ml'den 10 NalR koloni elde edilirse 1 ml'den 100 NalR koloni elde edileceği varsayılır.
AÇIKLAMA: Mutator genleri içeren bakteri mutantlarında spontan mutasyon sıklığı oranı yaban tiplerine kıyasla daha fazladır. Bu deneyde de her iki suşda spontan olarak Nalidiksik asite karşı dirençlilik ölçümüyle suşlar arasında kıyaslama yapılacaktır.
E.coli
HÜCRELERİNE UV (ULTRAVİYOLE) IŞINI UYGULAMASI VE CANLI KALAN HÜCRELERİN
TESPİTİ
GİRİŞ
Bir bakteri kültürü, öldürücü dozda UV ışığına maruz kaldığında, hücrelerin muhtemel bir canlı kalma olasılığı vardır. Şayet bu canlı kalma olasılığı (probility) 0.1 ise, o zaman kültürün %10'u canlı kalacaktır. Canlı kalan bakteri hücrelerine yine aynı oranda doz verilirse, bu hücrelerde canlı kalma olasılığı yine aynı oranda kalacaktır. Fakat doz oranı iki katına çıkarılırsa, hücrelerdeki canlı kalma olasılığı muhtemelen 0.1 x 0.1= 0.01 (%1) olacaktır.
Şayet canlı hücrelerin sayısı, belli zamanlarda verilen UV ışınlarına karşı logaritmik grafik kağıdına işlenirse, bu durumda UV ışınına karşı logaritmik canlı hücre sayımı elde edilir. Uygulanan doza karşı canlı kalan hücrelerin sayısının logaritmik değeri "semi-log" logaritmik kağıdına da işlenebilir. Canlı kalan hücrelerin grafik üzerinde gözlenen eğimi, hücrenin UV ışınına hassas bölgesinin harap edilmesini (bir foton tarafından harabiyet) yansıtır. Şayet bu harabiyet, çok kolay olursa, grafik eğimi keskin olur. Harabiyet zor olursa, grafik eğimi daha geniş bir omuz yapar. Bu grafik eğimini etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bunlardan bazılarını şöyle sıralayabiliriz:
1- Kültürün Yoğunluğu: Üreyen kültür çok yoğunsa, bakteri hücrelerinin bazıları diğerleri tarafından "kalkan tipi" korunabilir. Böylece UV ışınlarının tüm hücrelere nüfus etmesi engellenebilir. Bu durumda canlı hücrelerdeki grafik eğimi geniş omuzlu (concave upwards) olacaktır.
Bakteri canlı hücre sayımı 1 x 108 ml-1 'den az ise "kalkan tipi" koruma pratikte önem kazanmaz. Bu durumda bakterileri UV ışınına maruz bırakmak için logaritmik üreme dönemindeki hücreler ile çalışmak daha doğrudur.
2-Sıvı Vasatın Doğal Yapısı: Nütrient broth, tampon çözeltilere nazaran daha fazla UV absorblar. Bu nedenle Nütrient broth'lu bakteri kültürü UV ışınına maruz bırakılınca, etkili UV dozu düşürülmüş olur. Bunun yanı sıra, UV etkisine bırakılan Nütrient broth'da toksik organik peroksidler oluşabilir. Bu durumda da UV ışınının etkisinin daha uzun sürede gerçekleşmesi söz konusudur.
3-Hücrelerin Fizyolojik Koşulları: UV ışınlarının hedef bölgesi DNA'dır. Çok çekirdekli hücrelerin UV ışınına maruz kalması sonucunda bir çekirdeğin ışınlardan etkilenmediğini varsayarsak, hücrenin yaşama şansı fazla olacaktır. Oysa aynı dozdaki etki, tek çekirdekli hücreye daha fazla zarar verecektir. UV radyasyonunda en öldürücü ve mutajenik dalga boyu 260 A° dur. İn vitro çalışmalardan öğrenildiğine göre pürinler UV ışınlarına bağlı olan kimyasal değişmelere kısmen dayanıklıdır. Fakat pirimidinlerin en az iki mekanizmayla değişikliğe uğradığı tespit edilmiştir. Bunlardan biri, hidrasyondur (hydration). Bu durumda suyun pirimidinlerdeki 5-6 çift bağlarına ilavesi söz konusudur. Fakat bu reaksiyonun biyolojik bir önemi yoktur. Diğeri ise, pirimidin dimerleşmesidir. Genellikle komşu iki timin dimerleşmeye daha yatkındır. Bu ikinci durum biyolojik ve genetik açıdan önemlidir. Bugünkü deneyinizde, teorik derslerde öğrendiğiniz, "karanlıkta onarım" ve "ışıkta onarım" (fotoreaktivasyon) mekanizmalarını inceleyeceksiniz.
Işıkta onarım; UV ışığının etkisiyle DNA da oluşan Timin dimerleri arasındaki kovalent bağ, 540 nm dalga boyundaki görünür ışığın etkisiyle aktive olan Fotoliyaz enzimi ile direkt olarak kırılır. Bu şekilde DNA daki hasar doğrudan giderilmiş olur. Fotoreaktivasyon mekanizması için mutlaka görünür ışığa gereksinim vardır.
Karanlıkta onarım (Excision repair); fotoreaktivasyonun aksine bu onarım mekanizması için görünür ışığa gereksinim yoktur. DNA da Timin dimerinin bulunduğu bölgedeki, doğru bazları da içeren yaklaşık 8-12 nükleotidlik kısım uvrABC ekzinükleaz (iki uçtan da kesen) aktivitesi ile kesilir.Kesilen oligonükleotid Helikaz II enzimi ile DNA dan uzaklaştırılır. DNA nın hasarlı kısmındaki bu boşluk DNA Polimeraz I enzimi ile karşı iplikçik kalıp olarak kullanılarak doldurulur. Daha sonra iki serbest uç DNA Ligaz enzimi ile birleştirilir. Bu şekilde hasar onarılmış olur.
ARAÇ VE GEREÇLER
A) E. coli K12 suşu 5 ml (log fazında)
B) 7 steril seyreltme tüpü (içlerinde 9 ml NaCl var)
C) 0.1 ve 1 ml'lik 10'ar pipet
D) Semi-log grafik kağıdı.
İZLENECEK YOL
Nütrient agar vasatlarına logaritmik fazdaki E. coli K12 hücrelerini seyreltme metoduyla 0.01 ml'lik oranlarda damlatma suretiyle ekeceksiniz.
Size verilen kültürü 10'luk seriler halinde 10-7 ye kadar seyreltiniz. Sonra her seyreltmeden steril bir pipetle aldığınız bakteri kültürünü 0.01 ml'lik miktarlarda 6 adet Nütrient agar plağında aynı yere damlatınız. Bu işlemi bütün seyreltmeler için yapınız ve her seyreltme için steril bir pipet kullanınız. Ekim işlemi bittikten sonra 0.01 ml'lik damlaların kurumasını bekleyiniz. Kuruma tamamlandıktan sonra 4 adet Nütrient agardan birini masanızda bırakınız. Diğer 3 adet Nütrient agara sırayla 30", 60", 90" sayılarını yazınız ( " işareti, saniye anlamına gelmektedir). Bu vasatlara karanlık odada (kırmızı ışık yanacak), UV lambası altında, Nütrient agarlı petri kaplarında yazılı saniye kadar UV dozu veriniz. Sonra UV dozu vermediğiniz Nütrient agar vasatıyla birlikte toplam 4 adet vasatı 37°C'lik etüve kaldırıp bir gece bekletiniz. Ertesi gün bu vasatlarda fotoreaktivasyonu gözleyeceksiniz. Bir başka öğrenci grubu da UV dozları verilen bu petri vasatlarını alüminyum folye ile sararak 37°C'lık etüve kaldırıp bir gece inkübe edecektir. Ertesi gün bu vasatlarda karanlıkta onarımı gözleyeceksiniz.
(Canlı kalan bakteri hücrelerini sayıp logaritmik grafik kağıdına geçirerek UV ışınlarına maruz kalan bakterilerde canlı kalma oranını gözleyebilirsiniz.)
2.
DENEY
BAKTERİLERDE
(E. coli) OKSOTROFİK GEREKSİNMELERİN ÇİZGİ TESTİ METODUYLA MİNİMAL
AGAR (MA) VASATINDA GÖZLENMESİ
GİRİŞ
Escherichia coli suşunda oksotrofik gereksinimlerin belirlenmesinin bir yolu da minimal agar (MA) vasatlarına yapılan ekimlerle anlaşılır. Bugünkü deneyinizin amacı da sizlere verilen iki E. coli Oksotrofik mutantının MA'da üreyebilmesi için nelere gereksiniminin olduğunun belirlenmesi olacaktır. Oksotrofik mutantlar üremeleri için belirli amino asitlere, vitaminlere, purin-pirimidin bazlarına ihtiyaç gösterebilir. Size verilen iki oksotrofik E. coli mutantının gereksinimlerini de aşağıda açıklandığı şekilde izleyeceksiniz.
ARAÇ VE GEREÇLER
A) İki E. coli mutantı (Nütrient agarda ekili)
Sex Karakteristik KL398 Dişi metE-, leu-, proC-, hisF-, thyA-, thi-,
lacZ36, ara-, mtl-, xyl-, StrR, SpcR
HfrCavalli Erkek met-, thi-, StrS
Semboller: met: metionin, leu: leusin, pro: prolin, his: histidin, thy: timin,
thi: thiamin(vit. B1), lac: laktoz, ara: arabinoz, mtl: mannitol,
xyl: ksiloz, Str: Streptomisin, Spc: Spektinomisin,
MA: Minimal agar (Agar+Tuzlar+Glikoz)
B) Steril kürdanlar (tüpler içinde)
C) Minimal agar plak tipleri:
a) KL398 için:
1) MA+leu+pro+his+thy+B1+Str. (met yok)
2) MA+met pro+his+thy+B1+Str. (leu yok)
3) MA+met+leu+his+thy+B1+Str. (pro yok)
4) MA+met+leu+pro+thy+B1+Str. (his yok)
5) MA+met+leu+pro+his+B1+Str. (thy yok)
6) MA+met+leu+pro+his+thy+B1+Str. (KL398'in ürediği orijinal vasat)
b) Hfr Cavalli için:
1) MA+B1 (met yok)
2) MA+B1+met (Hfr Cavallinin ürediği orijinal vasat)
3) MA+B1+Met+Str.
İZLENECEK YOL
Araç ve gereçler bölümünde iki E. coli hücresinin genotipi verilmiştir. Bu suşlardan KL398, adi MA da üremez. Bu suşun üreyebilmesi için adi MA'a, en az dört amino asit (met, pro, leu, his), bir pirimidin bazı (thy) ve bir vitamin (B1) ilave edilmesi gerekir. (Deney boyunca masanızdaki bunzen-bekini yanar bırakınız.)
Şimdi siz sırayla şu işlemleri yapın:
a) KL398'e ait MA+amino asit plaklarını masanızın üstüne yanyana gelecek şekilde yerleştiriniz. En sona orijinal vasatı koyunuz. (Plakların altına size verilen karton daireleri koymayı unutmayınız.)
b) Steril kürdanların bulunduğu tüpü masanın üstüne yatay yatırıp, tüpün ağzındaki pamuğu çıkarınız. Kürdanlarınızı geniş ucu tüp içinde, dar ucu da 1-2 cm tüpün dışına çıkacak şekilde ayarlayınız.
c) Tüpdeki kürdanlardan birini alıp alevden geçiriniz ve Nütrient agardaki KL398'in kolonilerinden birini, elinizdeki steril kürdanın geniş ucuyla agar yüzeyinden alarak, 1-6 nolu plakların aynı noktasına sırayla çizerek ekiniz. Unutmayınız ki elinizdeki kürdandaki koloniyi tam altı kez, altı ayrı plağa ekeceksiniz. Kürdanla ekerken agar yüzeyinin delinmemesine ve çok hafif şekilde agar yüzeyine bakteri hücrelerinin değmesine dikkat edeceksiniz. İşlem tamamlandığında siz, sadece bir tek koloniyi kontrol etmiş olacaksınız. Master plağınız olan Nütrient agar yüzeyindeki diğer kolonileri de aynı şekilde çizgilerle ekerek kontrol edebilirsiniz.
d) Ekim işlemi bittikten sonra plaklar 37°C lik etüvde bir gece inkübe edilip, ertesi gün üremeleri gözleyeceksiniz.
Benzer çizgi testini, Hfr Cavalli için de tekrar edeceksiniz. Hfr Cavalli kolonilerini sadece 3 plağa ekeceksiniz.
E.coli
'DE KONJUGASYON
GİRİŞ
Bakterilerde DNA aktarımları çeşitli mekanizmalarla olur. Transformasyon, transdüksiyon, konjugasyon ve epizomal aktarım gibi.
Sizler de bu deneyinizde bir suştan diğerine gen aktarımını konjugasyonla yapacaksınız. Bilindiği gibi, genini aktardığınız suşa "verici" (donor), bu geni (leri) alan suşa da "alıcı" (recipient) denir. Ancak konjugasyonda verici "erkek", alıcı da "dişi" suş olarak adlandırılabilir. Çünkü konjugasyon sexüel bir gen aktarma şekli olup, mutlaka erkek ve dişi bakteri hücreleri arasında olur.
Sex faktörü içeren (F-faktör) bakteriler, erkek bakteri olarak adlandırılır. Bu sex faktörü sitoplazmada; ya tek başına bağımsız (F+), ya da sex faktörle birlikte bir veya birkaç gen uzunluğunda kromozomal DNA segmenti içerebilir (F-prime). Bazen de sex faktörü, bakteri kromozomuna entegre olabilir (katılabilir) (Hfr; High frequency of recombination=yüksek sıklıkta rekombinant yapan).
Çeşitli Hfr tipleri vardır. Bunlar sex faktörün kromozoma çeşitli bölgelerde integrasyonu ile oluşur. Hfr suşu da F faktörün kromozoma integre olduğu bölgeden itibaren DNA'sını dişi bakteriye aktarır. Bu aktarım işi ve konjugasyon mekanizması sizlere teorik ders saatinde daha geniş anlatılacaktır. Genel konjugasyonda teorik olarak, bir erkek bakterinin dişiye tüm genlerini aktarma şansı için 90-100 dakikalık bir süre tanınır. Kesintili konjugasyonda bu süre, aktarılmak istenen genin kromozomdaki yerleşme pozisyonuna göre bir limite indirilebilir.
ARAÇ - GEREÇLER
ve İZLENECEK YOL
A) Erkek ve Dişi E. coli Suşları
Sex Karakteristik
KL398 Dişi(F-) metE-, leu-, proC-, hisF-, thyA-, thi-, LacZ36, StrR
Hfr Cavalli Hfr(F+) met-, thi-, StrS
B) Sıvı Bakteri Kültürlerini ekimle yaymak için cam çubuk yayıcılar, sterilizasyon için alkol ve steril
pipetler.
C) Steril konjugasyon tüpleri veya şişeleri
D) MA= Minimal Agar plakları. Bu plaklarda KL398'in orijinal üreme vasatından sadece bir amino
asiti veya timini yok. Tüm plaklar streptomisin (200 µg/ml) içeriyor.
Nütrient Broth'da log fazında üremiş erkek bakteriden 1 ml alınıp steril konjugasyon şişesine konur ve hemen üzerine yine log fazında üremiş dişi bakteriden 2.5 ml konup, karıştırılarak 37°C'lik etüve kaldırılır. Karışım etüvden 90 dakika sonra alınıp, seleksiyonu yapılacak genler için, 0.1 ml kültür ortamı, MA plaklarına yayılır ve 37°C'lik etüve kaldırılır. Plaklar etüvden 48 saat sonra alınır. Bu durumda teorik olarak konjuge halindeki hücrelerden pek çok rekombinant elde edeceksiniz.
Deney sırasında gerek erkek ve gerekse dişi bakteri kültürleri MA plaklarına ekilir. Bu kültürler kontrol plağı olarak kullanılır.
3.
DENEY
KOLİSİN
FAKTÖR VARLIĞININ GÖZLENMESİ
GİRİŞ
Plazmid olan Kolisin faktörlerin pek çok örneği ekstrakromozomal element olarak izole edilmiştir. Ayrıca kolisin yapımından sorumlu kolisin geninin de (col gen) kromozoma entegre olduğu rapor edilmiştir. Kolisin faktörler bulundukları bakteri konakçı hücresinin türüne göre de o konakçı içinde duplike olabilir veya olamaz. Kolisin faktörlerin en karakteristik özelliği kolisin adı verilen bir protein antibiyotiğinin üretiminden sorumlu olmalarıdır. Bu antibiyotik kolisine hassas olan bakteri suşlarının ölümüne yol açar. Kolisinin varlığı, hem bulundukları konakçıları, hem de diğer bakterileri olumsuz yönde etkilerse de ekolojik denge bağırsaklarda proteazlarca sağlanır. Proteazlar kolisini inhibe ederler. Kolisin faktörler molekül ağırlıklarına göre ikiye ayrılırlar. Birinci grupta incelenen kolisin faktörlerin (ColD, ColE1, ColE2, ColE3 ve ColK) molekül ağırlıkları yaklaşık 5x106 olup tahminen 30.000 molekül ağırlığında 10 protein için yeterli DNA içerirler.
İkinci grupta incelenen ColB, ColIb, ColV'nin molekül ağırlıkları yaklaşık olarak birinci grup Kolisin faktörlere kıyasla en az 10 kat daha büyük olup, 62x106 ile 94x106 arasındadır. Bunlar da 30.000 Molekül ağırlığında 100 farklı proteini kodlayacak düzeyde yeterli DNA içerir. Kolisin faktörleri bu şekilde gruplandırmada çeşitli Genetik ve Fizyolojik özelliklerin de rolü olmuştur. Örneğin ikinci grubu oluşturan daha büyük kolisin faktörler (Plazmid büyüklükleri içerdikleri DNA miktarı ile ilgilidir) konjugatiftirler. Yani kendilerini diğer uygun konakçılara aktarabilirler.
Hassas Bakteri Hücrelerinde Kolisin Tutunması ve Kolisin Etkisi: Escherichia coli hücresinin dış membranında, protein yapıda çok çeşitli kolisin reseptörleri teşhis edilmiştir. Tamamen olmasa da bazen, kolisine hassas suşların elde edilmesine bu resöptörlerin değişimi veya kaybı neden olur. Bazı fajlar ve kolisinler aynı reseptöre bağlanır. Hatta bazen bu reseptörler vitamin B12 gibi bazı metabolitlerin ve Fe+3 in hücre içine taşınmasında görev alırlar. Örneğin Faj BF23, kolisin E3 ve vitamin B12, E. coli 'nin dış membranındaki aynı reseptöre tutunurlar. Reseptöre tutunduktan sonra da; faj DNA'sı hücreye enjekte olur. Kolisin hücre duvarını delerek (penetrate) bakteri ribozomunu parçalar ve hücreyi öldürür. Vitamin B12 ise hücre içine taşınır (transportation). Faj BF23'e rezistan (dayanıklı) bir E. coli suşu kolisin E3'e de rezistandır. Çünkü Faj BF23'e rezistan suşda reseptör yapısı değişmiştir. Bu nedenle bu suş aynı reseptörü kullandığından kolisin E3 (ColE3)'e rezistandır.
Hücrelerin ölümüne neden olan kolisin moleküler etkisini de 3 sınıfta toplayabiliriz:
1) ColE1 ve ColK gibi kolisinler sitoplazmik membranda etkili olup enerjiye bağımlı transportları (taşıma) inhibe eder. Örneğin kolisin etkisine bırakılmış hücrelerde potasyum iyonunun kaybı gizlenmiştir.
2) ColE2 hücreye girdikten sonra hücre bölünmesini inhibe eder ve DNA'yı parçalar.
3) ColE3 protein sentezini 16-S ribozomal RNA'yı kırarak engeller.
DENEYİN YAPILIŞI
I.Gün:
Bugünkü deneyinizde size verilen bir E. coli suşu, sitoplazmasında plazmid olarak ColK içeriyor. Sizler ColK'nın varlığını şu şekilde gözleyeceksiniz: Master plaklarda ekili ColK içeren KH322 E. coli suşundan alınan koloniler bir Nütrient agar plağının çevresine eşit aralıklarla öze veya steril kürdan ucu ile nokta şeklinde ekilir. Bir koloni de plağın ortasına ekilir. Bir NA plağına 5 koloni ekimi yapılıp 37°C lik etüve konulur.
II. Gün:
Sabah etüvden alınan plaklar, içinde birkaç ml kloroform içeren saat camı üzerine kapatılıp 20 dakika beklenir. 20 dakika sonra plaklar saat camından alınıp 3-4 dakika plakların ağzı bunzen beki yanında açık tutularak nutrient agar yüzeyinde difüze olmuş kloroformun buharlaşması sağlanır. (Burada kloroformu kullanmadaki amaç bakteri büyümesini inhibe etmek ve bakteri çoğalmasını durdurmaktır). Bu işlem de tamamlandıktan sonra 45°C'lik su banyosunda 3 ml yumuşak agar (soft agar) içinde 0.3 ml kolisine hassas bakteri (Hfr) içeren tüpler alınarak kloroformlanmış Nütrient agarlar üzerine yayılır. Yumuşak agarların donması 3-4 dakika alır ve bu süre sonunda üzerleri yumuşak agar içinde dağılmış kolisine hassas bakteri ile kaplanmış Nütrient agar plakları 37°C lik etüve konur.
III. Gün:
Etüvden alınan Nütrient agar plaklarındaki kolonilerin etrafında görülen zonlar ColK (Kolisin K)' dan kaynaklanmaktadır.
Bu zonlar içinde kalan hücreler Kolisin K tarafından öldürülmüş ve bakteri hücrelerinin üremediği temiz sahalar (clear area) oluşmuştur.
İNDİKATÖR
VASAT OLARAK KULLANILAN EMB-LAKTOZ AGAR PLAKLARINDA LAKTOZ POZİTİF (LAC+) VE
LAKTOZ NEGATİF (LAC-) E. coli SUŞLARININ GÖZLENMESİ:
GİRİŞ
Bakteri Genetiği ve Moleküler Biyoloji'de indikatör vasatlar kullanmak suretiyle bakteri kolonilerinin görünüşü, bize o suşların fenotipleri hakkında bilgi verebilir. Uygun indikatör vasat kullanmak suretiyle kolonilerin renklerine göre de pekçok farklı fenotipte bakteri izole edilir ve bu suretle mutant tiplerin elde edilme yoluna gidilir. EMB, tetrazolyum ve MacConkey gibi indikatör vasatlarda, spesifik karbohidratları metabolize eden ve etmeyen kolonilerin seçimi yapılabilir.
Biz bugünkü deneyimizde, indikatör plak tekniği ile iki E. coli mutantının fenotipini belirleyeceğiz. İndikatör olarak aşağıda formül özelliklerini yazdığımız EMB-Laktoz agarını kullanacağız.
EMB (eosin-metilen blue veya eosin - metilen mavisi) vasatında bulunan karbohidratı (biz laktozu kullanıyoruz) fermente eden bakteri kolonileri koyu renkte ve genellikle koloni üzerleri metalik yeşil kılıfla kaplıdır (metalik röfle). Laktozu çabuk ve hızlı fermente eden bakteriler kısa sürede fazla asit oluştururlar. Besiyeri yüzeyinde pH düşer (pH 4.8). Bu asitin bazik metilen mavisine ilgisi vardır. Laktozdan oluşan asit boya ile konjuge olur. Koloni fazla miktarda boya absorbe ederse bu bölgelerde bazik metilen mavisinin kuruması ile madeni bir parıltı oluşur. Laktozu fermente edemeyen bakteri kolonileri ise açık renkte (beyaz veya pembe renkte) gözlenirler. Laktozu kesinlikle fermente edemeyen Lac- suşlarının kolonilerinde metalik yeşil kılıf gözlenmez.
Ayrıca EMB-Laktoz agarı klinikte; Escherichia coli, Aerobacter aerogenes ve Candida albicans 'ın teşhisinde de kullanılır.
EMB-Laktoz Agarının Özelliği: Bir litre distile su içinde eritilen 10 g peptone, 10 g laktoz, 2 g Dipotasyum hidrojen fosfat, 0.4 g Eosin Y, 0.065 g Metilen blue ve 15 g Agar, 121 °C'da 15 dakika otoklav edilerek steril hale getirilir. (Şayet başka bir karbohidrat mutantını kontrol etmek isterseniz, laktoz yerine o karbohidratı koyarsınız.)
DENEYİN YAPILIŞI
Sizlere verilen E. coli KL398 (Lac-) ve HfrCav (Lac+) suşlarının master plaklarından alınan birer koloniyi öze ile EMB-Laktoz agarına ekin ve 37 °C'lık etüve kaldırarak 72 saat sonra iki suşun kolonilerinin fenotipik özelliğini kıyaslayınız.
4.
DENEY
SOĞAN’DAN
DNA İZOLASYONU
DENEY
1. Soğanın iç kısmından 4 cm kenarlı 4 adet küp çıkarılır.
2. Çıkarılan parçalar blendır içerisine konur; üzerine önceden hazırlanmış olan Solusyon A dan 100 ml eklenir.
3. Blendırda 1 dk örnek parçalanır.
4. Karışım kahve filtresinden süzülür.
5. Üzerine 30 ml ananas suyu ilave edilir. Hafifce sallanarak karıştırılır.
6. Karışımdan 6 ml alınarak deney tüpüne konulur. Üzerine soğuk Absolut (%99,5) Etil alkolden 6 ml ilave edilir. İki faz oluşumu gözlenir
7. Tüpü hareket ettirmeden 4-5 dk. beklenir. (Kabarcık çıkışı bitene kadar)
8. Üst fazda soğan DNA’sı gözlenir.
Solusyon A' nın hazırlanması;
20 gr Tuz (İyotsuz , Safra Tuzu)
20 ml sıvı deterjan (Pril losyon)
+ 180 ml Distile su
200 ml son hacim
Gerekli Malzemeler
1.Tuz
2.Sıvı Deterjan
3.Distile Su
4.Absolut Etil Alkol (%99,5’luk)
5.Ananas Suyu
6.Kahve Filtresi
7.Soğan
8. 10 ml’lik cam tüpler
DNA'NIN
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ
Moleküllerin sahip oldukları net elektrik yükleri bu moleküllerin bir elekriksel alan içindeki hareketlerini etkiler. Elektroforez tekniği bu prensibe dayanır. Moleküllerin büyüklüklerine göre ayrılabilme özellikleri, jel elektroforezinin pek çok amaç için kullanımına olanak sağlamıştır. Nükleik asit fragmentlerinin tanımlanması, saflaştırılması ve ayrılması için kullanılan en yaygın yöntem agaroz jel elektroforezidir. Bu nedenle çeşitli amaçlar için izole edilen DNA ve RNA'ların tanımlanabilmesi, temizliğinin kontrolü, hangi formda olduğunun belirlenebilmesi, büyüklüğünün saptanabilmesi ve özellikle genetik mühendisliği teknikleri ile DNA yapısında oluşturulan değişikliklerden sonra elde edilen yeni formların incelenmesi yönünden, agaroz jel elktroforez tekniği, moleküler genetik alanında önemli bir deneysel sistem oluşturmaktadır.
Agaroz jellerin ayırma gücü poliakrilamid jellere oranla daha düşük olmakla birlikte, ayırabildikleri DNA parçaçıklarının uzunlukları 200 baz çifti (bp) ile 50 kilo baz (kb) gibi oldukça geniş bir aralıkta olabilmektedir. Agaroz jeldeki örnekler genellikle yatay pozisyonda, sabit güç ve yöndeki elektriksel alanda yürütülmektedir.
Agaroz, deniz yosunlarından elde edilen, dallanmamış zincirli bir polimerdir. Ticari olarak satılan agaroz tamamen saf olmayıp, diğer polisakkaritler, tuzlar ve proteinlerle birlikte bulunabilir. Bu kirliliklerin oranı, hem DNA'nın jeldeki hareketini hem de jelden elde edilecek DNA'nın enzimatik reaksiyonlardaki substrat olma yeteneğini etkiler.
Agaroz Jelde DNA'nın
Hareket Hızını Etkileyen Etmenler:
a) DNA'nın Molekül Büyüklüğü: Çift zincirli doğrusal DNA moleküllerinin jeldeki hızı, baz çifti sayısının logaritması ile ters orantılıdır. Büyük moleküller, sürtünmenin büyük olması ve jeldeki porlar arasında daha zor yol bularak ilerlemelerinden ötürü, daha yavaş haraket ederler.
b) Agaroz Konsantrasyonu: Belirli büyüklükteki doğrusal bir DNA molekülü, değişik agaroz konsantrasyonlarındaki jellerde farklı hızlarla ilerlerler. DNA'nın elektroforetik hareketliliğinin logaritması ile jel konsantrasyonu arasında bir ilişki vardır. Dolayısıyla değişik konsantrasyonlardaki jellerin kullanılmasıyla çok farklı boyutlardaki DNA moleküllerini ayırmak mümkündür (Tablo 1 ).
Tablo 1. Değişik konsantrasyonlarda agaroz içeren jellerde ayrılma aralıkları
Jeldeki agaroz miktarı Doğrusal DNA moleküllerinin ayrılma aralığı
% [ w/ v] (kb)
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3
c) DNA'nın Konformasyonu: Aynı molekül ağırlığında süperkıvrımlı çembersel , tek zincir kırığı içeren çembersel ve doğrusal DNA molekülleri, agaroz jellerde farklı hızlarla ilerler. Bu üç formun bağıl hızları temelde jelin agaroz konsantrasyonuna bağlı olmakla birlikte, uygulanan akımın gücü, tamponun iyonik gücü, süperkıvrımlı çembersel DNA'daki süperkıvrımların sayısı da hızı etkileyen faktörler arasındadır.
d. Uygulanan Voltaj: Düşük voltajlarda doğrusal DNA parçalarının hareket hızları, uygulanan voltajla doğru orantılıdır. Bununla birlikte, elektriksel alanın gücü arttıkça büyük molekül ağırlıklı DNA parçalarının hareketi farklı ölçülerde artar. Bundan ötürü voltajın artmasıyla agaroz jeldeki etkili ayırım aralığı azalır. Büyüklükleri 2 kb'dan daha fazla olan DNA parçalarını en iyi şekilde ayırabilmek için agaroz jeller 5 volt / cm'den fazla olmayan akımla yürütülmelidir.
e) Baz Bileşimi ve Sıcaklık : DNA moleküllerinin agaroz jellerdeki davranışları baz bileşimleri ve jelin yürütüldüğü sıcaklık derecesi tarafından çok fazla etkilenmez. Dolayısıyla değişik boylardaki DNA moleküllerinin agaroz jeldeki bağıl hareketi 4-30 0C arasında değişmez. Jeller genellikle oda sıcaklığında yürütülür. Bununla birlikte, %0.5'den az agaroz içeren jellerin 4 o C'da yürütülmesi daha uygundur.
f) İnterkalasyon Yapan Ajanların Varlığı: Agaroz ve poliakrilamid jellerde DNA'nın gözlenmesi için kullanılan floresan karakterdeki etidiyum bromür boyası, doğrusal DNA moleküllerinin elektroforetik hareketini % 15 oranında azaltır.
g) Elektroforez Tamponunun Bileşimi: DNA'nın elektroforetik hareketi, elektroforez tamponunun bileşimi ve iyonik gücü tarafından etkilenir. İyonların yokluğunda (örn. hata sonucu jele tampon eklenmemesi durumunda) elektriksel iletkenlik minimum düzeydedir ve DNA'nın hareketi çok yavaştır. Çok yüksek iyonik güçteki tamponun kullanılması halinde (örn. yanlışlıkla 10x elektroforez tamponu kullanıldığında), elektriksel iletim çok fazladır ve çok fazla ısı açığa çıkar. En kötü durum jelin erimesi ve DNA'nın denatüre olmasıdır. Doğal çift zincirli DNA'lar için değişik tamponlar kullanılabilir. Bunlar arasında EDTA (pH 8.0), pH 7.5-8.5 olan yaklaşık 50mM konsantrasyondaki Tris-asetat (TAE), Tris-borat (TBE) ya da Tris-fosfat (TPE) kullanılabilir. Elektroforez tamponları genellikle konsantre çözeltiler halinde hazırlanır ve oda sıcaklığında saklanır.
Düşük iyon kapasitesine ait elektroforez tamponları elektriksel iletkenlikleri de daha düşük olduğundan uzun süreli (gece boyu) elektroforez işlemlerinde az ısınmaktadır. Bu nedenle düşük akım kullanılarak gerçekleştirilen uzun süreli elektroforez işlemlerinde tercih edilir. Yüksek iyon kapasitesine sahip kapasitesine elektroforez tamponları ise çabuk ısındıklarından kısa süreli elektroforez işlemlerinde kullanılır.
İZLENECEK YOL
I. Agaroz Jelin Hazırlanması:
1- Temiz ve kuru cam tabakanın kenarları otoklav bandı ile sarılarak, bir kalıp oluşturulur. Bu plaka yatay durumda düzgün bir yere yerleştirilir.
2- Bu deneyde elektroforez tanklarını doldurmak ve jel hazırlamak için TBE tamponu kullanılmaktadır. Erlenmayer içindeki elektroforez tamponuna %0.7 konsantrasyonda olacak şekilde toz agaroz eklenir. Tampon erlen veya şişenin yarısından fazlasını aşmamalıdır.
3- Tampon içindeki agaroz eriyene kadar kaynar su banyosunda ya da mikrodalga fırında tutulur. Agaroz taneciklerinin mümkün olan en kısa sürede erimesi sağlanmalıdır. Kap düzenli olarak karıştırılmalı ve çeperlere yapışan taneciklerin çözeltiye katılması sağlanmalıdır. Buharlaşma sonucu hacimde azalma olursa gerekli miktarda su eklenmelidir.
4- Çözelti 60 oC'ye kadar soğutulur.
5- DNA'nın uygulanacağı kuyucukları oluşturmak için cam plakanın yüzeyinden yaklaşık olarak 0.5-1 cm yukarıya tarak yerleştirilmelidir. Eğer tarak cam plaka yüzeyine çok yakın olacak şekilde yerleştirilirse tarağın çıkarılması sırasında jelin yırtılması söz konusu olabilir.
6- Ilık agaroz çözeltisi kalıbın içine dökülür. Jelin kalınlığı 3-5 mm arasında olmalıdır tarağın dişleri arasında ya da altında hava kabarcılarının kalmamış olmasına dikkat edilmelidir.
7- Jel oda sıcaklığında yaklaşık 30-45 dakikada polimerleşir. Jel polimerleştikten sonra tarak ve otoklav bandı dikkatle çıkarılır ve jel elektroforez tankına yerleştirilir.
II. Örneklerin Yüklenmesi
1- DNA örnekleri istenen bir jel yükleme tamponuyla toplam hacim 5-20 m l olacak şekilde karıştırılır. Bu karışım bir mikropipet ile yaklaşık 1 mm derinliğindeki tampon içinde gömülü halde bulunan jelin kuyucuklarına yavaşça yüklenir. Bu deneyde bromfenol mavisi ve sükroz içeren yükleme tamponu kullanılmaktadır. Jel yükleme tamponları üç amaç için kullanılırlar;
a) Örneğin yoğunluğunu arttırarak DNA'nın kuyucuğa düzgün olarak çökmesini sağlarlar.
b) Örneği renklendirerek, yükleme işlemini basitleştirirler.
c) Elektriksel alanda anoda doğru hızla hareket ederler. Hangi yükleme tamponunun kullanılacağı araştırıcının tercihine bağlıdır.
2- Jelin sağ ve solundaki ilk kuyucuklara bilinen büyüklükteki marker DNA'lar yüklenir. Büyüklükleri bilinmeyen DNA'larla çalışırken, bütün örneklerin aynı tampon içinde çözülmüş olması gerekir.
III. Örneklerin Yürütülmesi
1- Tankın kapağı kapatılır ve elektrik bağlantıları yapılır. DNA, anoda (kırmızı uca) doğru hareket eder. Uygulanan voltaj 1-5 V/cm olmalıdır. 10 cm boyundaki agaroz jel için 0.5-1 saat süreyle 20 mA'lik akım uygulanır. Elektrod uçları doğru bağlandıysa, ilk birkaç dakika içinde bromfenol mavisi kuyucuktan jele geçer. Jeldeki yürütme işlemi bromfenol mavisi uygun uzaklığa ilerleyene kadar sürdürülür.
2- Elektrik akımı kesilir, tel bağlantıları ve kapak çıkarılır.
IV. Agaroz Jel İçindeki
DNA'nın Boyanması
Agaroz jel içindeki DNA'yı görünür hale getirmenin en uygun yolu, floresan özellikteki Etidium bromür boyasını kullanmaktır. Bu boya DNA'nın bazları arasına interkalasyon yapabilen, düzlemsel yapılı halkasal bir grup içerir. DNA tarafından absorblanan 254 nm dalga boyundaki UV ışığı boya molekülüne aktarılır. DNA'ya bağlı boyanın kendisi de 302-366 nm arasındaki ışınları absorblar. Çevreye geri yayılan enerji, görünür ışık bölgesindeki (590 nm dalga boyunda) kırmızı-turuncu ışıktır. Böylece jeldeki DNA bandı görünür hale gelir. Etidium bromür hem tek ve çift zincirli DNA'yı hem de RNA'yı gözlemek için kullanılabilir. Ancak bu boyanın tek zincirli nükleik asit moleküllerine karşı ilgisi daha azdır.
Boyama işleminden sonra jel yüzeyi çok koyu boyanmışsa, bantları net olarak görebilmek için jel bir plastik kap içindeki suya daldırılır ve fazla boyadan arındırılır. Etidium bromür kuvvetli bir mutejen ve oldukça toksiktir. Bu boyayı içeren çözeltilerle çalışırken, eldiven giyilmelidir.
V. Fotoğraf Çekilmesi
Jellerin fotoğrafını çekmek için jeli alttan ya da üstten aydınlatan ultraviyole ışık kaynağı kullanılabilir. UV ışığı özellikle gözlere zarar verir. Bu ışığa maruz kalma riskini en aza indirmek için ışık kaynağı çok iyi kalkanlanmış olmalı ve koruyucu gözlük veya maske takılmalıdır.
DENEY
TBE tamponu kullanılarak %1’lik agoroz dökülür. Jel dökülürken kuyucukların oluşturulması için kullanılan tarak jelin orta kısmına gelecek şekilde yerleştirilir. Jel polimerleştikten sonra üzerine yürütme tamponu olarak 1 x TBE tamponu ilave edilir. Örnekler aşağıdaki şekilde hazırlanıp kuyucuklara yüklenir ve 70 V da yürütülür.
5 ml Boya
5 ml Sukroz (%40'lık)
Kullanılan Boya örnekleri
Molekül Ağırlığı (Dalton)
Janus Green B 511.0
Acid Yellow 332.3
Pyronin Y 302.8
Gention Violet 408.0
Bismarck Brown 419.3
Methyl Green 653.2
Elektroforez sonucunda Janus Green B ve Acid Yellow’un (+) (Pozitif) kutupa doğru hareket ederken, Pyronin Y, Methyl Green ve Gention Violet (-) (Negatif) kutuba doğru hareket eder. Bismarck Brown ise kuyuda hareketsiz kalır. Aynı zamanda boyaların Molekül Ağırlıklarıda hareket hızını etkilemektedir. (+) Kutuba doğru hareket eden boyalardan Janus Green B en önde ilerlerken Acid Yellow daha yavaş yürür. Diğer taraftan (-) kutupa hareket eden iki boyadan Pyronin Y önde giderken Gention Violet daha geride kalır.
DENEY
Methyl Green ile
DNA’nın boyanması
Kullanılacak
malzemeler:
Elektroforez tankı
Agaroz
1xTBE(Tris-Borik asit-EDTA) tamponu pH 8.0
Methyl Green
Soğan DNA'sı
Tek İplikli DNA
Fucsin
%40’lık sükroz çözeltisi
Yöntem
1. TBE tamponu kullanılarak %1’lik agaroz jel hazırlanır ve ateş üzerinde çözünmesi sağlanır. Bantların iyi görülebilmesi için jel ince dökülmelidir.
2. Kaynamış olan jelin üzerine konsantrasyonu 30 mg/ml olacak şekilde methyl green ilave edilir.
3. Jelin polimerleşmesi için yaklaşık olarak 30-45 dakikalık bir süre gereklidir.
4. Jel polimerleştikten sonra elektorforez tankına yerleştirilip üzerine 1xTBE tamponu koyulur.
5. Yüklenecek örneklerin üzerine %40’lık sükroz çözeltisi ve tek iplikli örneklere fucsin çift iplikli örneklerden her birine ise methyl green ilave edilir.
10 ml DNA
5 ml Sukroz (%40'lık)
Methyl Green
6. Elektroforez tankı ışıklı pan üzerine yerleştirildikten sonra 90 V akım verilerek örneklerin yürütülmesi sağlanır. Bantların daha iyi görünebilmesi için yürütme tamponu sadece jelin yüzeyini kapatacak şekilde kullanılmalıdır.
Hassasiyeti Etidium bromür’(EtBr ) den daha az olmasına karşın UV ’nin DNA üzerindeki zararlı etkisi engellenmiş olur. Ayrıca EtBr’ ün karsinojenik etkisi düşünüldüğünde labaratuvar çalışması için daha uygun bir boyama yöntemidir.
TBE Tamponu (pH=8.2)
Boyanın Hazırlanışı:
1 ml boya çözeltisi için 0,03 gr boya tartılarak 1 ml steril distile suda çözülür.
5. DENEY
SALMONELLA / MİKROZOM (AMES) TEST SİSTEMİ İLE MUTAJENİK ETKİNİN SAPTANMASI
Genel Bilgi
Çağdaş teknoloji, insanlara sunduğu kolaylıkların yanı sıra, büyük bir sorun olan çevre kirliliğini de birlikte getirmekte ve bu bütün canlıları olumsuz yönde etkilemektedir. Doğadaki tüm canlılar günlük yaşamda sık sık doğal ya da yapay kimyasal maddelerle yüzyüze gelmektedirler. (Gıdalarda bulunan doğal kimyasallar, pestisitler, gıda katkı maddeleri, saç boyaları,kozmetik ve ilaç gibi yapay kimyasallar, sigara dumanı, su ve havadaki kirleticiler gibi karmaşık bileşikler vb.)
Kimyasal maddelerin karsinojenik risklerini ortaya çıkarmak için en akılcı yaklaşım, deney hayvanlarında tümör indüksiyonudur. Ancak bu testler sonuçlanması uzun zaman almakta ve maliyetleri yüksek olmaktadır. Bu nedenle araştırıcılar karsinojenite taramalarına esas olabilecek kısa zamanda sonuç verebilen ve düşük maliyetli birçok kısa zamanlı mutajenite test sistemleri geliştirmişlerdir. Bu testler kimyasal maddelerin mutajenik etkilerini belirlemeye yöneliktir. Kısa zamanlı test sistemlerinden en yaygın olarak kullanılan, bakteriyel testlerdir. Bakteriler, basit üreme ortamlarında hızla ürediklerinden, basit, çabuk ve ucuz uygulanabilir olmalarından ötürü bakteriyel testler tercih edilmektedir.
Karsinojenlerin yaranmasında mutajenitenin esas alınması iki önemli nedene dayanır:
1. Genetik kodun ve genetik sistemin evrensel oluşu,
2. Karsinojenite ile mutajenite arasında korelasyonun yüksek oluşu.
Bakteriyel test sistemlerinde mutajen olduğu saptanan birçok bileşiğin aynı zamanda karsinojen olduğu gösterilmiştir. Karsinojen ve mutajenlerin neden olduğu özgül DNA hasarlarının tiplerini saptamada bakteriyel test sistemleri kullanılmaktadır. Kısa zamanlı bakteriyel test sistemleri, karmaşık kimyasal örneklerdeki mutajen bileşiklerin ve metabolik aktivasyon sonucu ortaya çıkan reaktif bileşenlerin saptanmasında analik araçlar haline gelmişlerdir.
SALMONELLA / MİKROZOM
(AMES) TEST SİSTEMİ :
Dr. B. Ames tarafından geliştirilen ve Ames testi olarak da adlandırılan Salmonella / mikrozom test sistemi, kimyasal maddelerin mutajenik etkilerinin araştırılmasında en yaygın olarak kullanılan, test parametreleri açısından en iyi standardize edilmiş ve mutajen-karsinojen etkisi en iyi bilinen kimyasaller ile geçerliliği en fazla kabul edilmiş kısa zamanlı bakteriyel test sistemlerinden birisidir.
Bu test sisteminde, S. thphimurium LT2 atasal suşundan in vitro mutasyonlarla elde edilmiş bir seri S. thphimurium mutant suşları kullanılmaktadır.
Bu suşların genetik özellikleri:
Histidin mutasyonu : Her test suşu, histidin operonunun değişik bölgelerinde çeşitli mutasyonlar içermektedir. Bunlar, ya DNA’daki tek bir bazın değişmesi ile ortaya çıkan baz değişimleri yada bir bazın eklenmesi yada çıkarılması ile kendini gösteren çerçeve kayması mutasyonlarıdır. Test edilen bileşiğin neden olduğu mutasyonun esas mekanizması, moleküler düzeyde bu suşlarla gösterilebilir .
Başlangıçta geliştirilen
his- mutantlarının çeşitli kimyasallara karşı duyarlılığını
artırmak üzere, bu suşlara aşağıda belirtilen bazı mutasyonlar eklenmiştir.
Rfa mutasyonu : Bu mutasyon, bakteri hücre duvarının lipopolisakkarit tabakasının kodlayan genlerde meydana gelir. Hücre duvarının lipopolisakkarit bariyerinin kısmen yok olmasını sağlayan rfa mutasyonu sonucu normalde hücre duvarından geçemeyen büyük moleküllerin hücre içine girişi kolaylaştırılmıştır.
uvrB mutasyonu : DNA onarım sisteminde kesip çıkarma(=excision repair) görevini üstlenen enzimi kodlayan uvrB genindeki delesyon sonucu oluşmuştur. UvrB mutasyonu, birçok mutajenin ortaya çıkarılmasında duyarlılığın artmasına neden olur. Ancak, teknik nedenlerden dolayı uvrB geninin kesilerek uzaklaştırılması sırasında bu delesyon biotin (bio) genine kadar uzanmaktadır. Bu nedenle, bakteriler üreyebilmeleri için histidinin yanında biyotinede gereksinim duyarlar.
R faktörü : Mutajenlerin daha iyi tayin edilebilmeleri amacıyla S. thphimurium TA 1538 ve TA 1535 suşlarına, ampisiline dirençlilik geni taşıyan pkM 101 R faktörü plazmidinin eklenmesiyle S.thphimurium TA 98 ve TA 100 suşları elde edilmiştir. Plazmid içeren suşların, muatjenik olduğu gösterilmiş ajanlara karşı cevapları, plazmid içermeyen suşlara göre oldukça yükselmiştir. Plazmid içeren yeni suşlar, orjinal suşlarla zayıf yada mutajen olmayan ajanlara karşı net bir pozitif cevap vermişlerdir. PkM 101 plazmidi, bu suşların daha duyarlı olmasından sorumlu olan hata oranı yüksek (error-prone repair)onarım sistemi ile bağlantılı gen ürünlerini içermektedir. Daha sonraki yıllarda,mutajenik özgüllüğü S. thphimurium TA 1537 ile aynı olan, ancak pkM 101 plazmidi taşıdığı için çerçeve kayması mutajenlerine karşı ondan daha duyarlı olan S. thphimurium TA 97 suşu geliştirilmiştir. Oksidatif mutajenleri saptamak amacıyla da, yeni bir suş olan S. thphimurium TA 102 suşu geliştirilerek kullanıma girmiştir. Bu suşda bir his G428 mutasyonu ve bir tetrasiklin dirençlilik geni taşıyan pAQ1 plazmidi bulunmaktadır.
Kendiliğinden Geriye Dönen Koloni Sayısı : Her test suşu, kendine özgü bir frekansla kendiliğinden geriye döner. S. thphimurium TA 98 suşu için kendiliğinden geriye dönen koloni sayısı 20-40, TA 100 suşu için ise 95-190 arasında bulunmuştur.
Salmonella / mikrozom test sistemine daha sonra rat karaciğeri 9000 x g supernatanını ve kofaktörleri içeren metabolik aktivasyon sistemi eklenerek memelilerdeki biyotransformasyon olaylarının benzeri sağlanmaya çalışılmıştır. Daha önceki çalışmalarda mutajen aktivite göstermeyen birçok prokarsinojenin, test sisteminin metabolik aktivasyonu içeren yeni uygulaması ile pozitif sonuç verdiği rapor edilmiştir.
Salmonella / mikrozom test sistemleri, kimyasalların mutajenitesinin saptanmasında oldukça geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Bu test sistemi, kimyasalların mutajenik özelliklerinin belirlenmesinin yanında antimutajenik özelliklerinin de belirlenmesinde kullanılmaktadır.
SALMONELLA / MİKROZOM
(AMES) TEST SİSTEMİNİN YAPILIŞI :
1. Test Suşlarının Üretilmesi ve Üreme Eğrisinin Çıkartılması : . S. thphimurium ile yapılan mutajenite testlerinde kullanılan bakteri kültürünün 1 ml’sinde 1-2 x 109 ml/bak., olması öngörülmektedir. Bu amaçla, . S. thphimurium test suşlarının üreme eğrileri çizilir. (Bu eğri zamana karşılık absorbans değerleri ve mililitredeki canlı bakteri sayısı olarak verilmektedir)
2. Salmonella / mikrozom test sisteminde kullanılan suşların genetik işaretlerinin kontrolü : Test sisteminin güvenirliliği açısından test suşlarının orjinal mutasyonlara sahip olup olmadıkları kontrol edilir.
a.
Histidin gereksinimi : Test suşlarının his- özelliği,
suşların MGA plaklarına ekilmeleri yoluyla kontrol edilir. Tüm test suşları
uvrB delesyonu nedeniyle histidine ek olarak biyotinede gereksinim duymaktadırlar.
Suşlar, histidin/biyotin içeren ve sadece biyotin içeren histidinsiz
minimal glukoz agarlı plaklara ekilir. Suşların histidin varlığında üreyip,
histidin yokluğunda ürememleri, his- karakterini doğrulamaktadır.
b.
R faktörünün kontrolü : Daha önce his-
karakterleri doğrulanan koloniler, ampisiline dirençlikleri açısından
test edilir. Bunun için histidin/biyotin/ampisilin içeren minimal glukoz
agarlı plaklar hazırlanarak R faktörü test edilecek suşların ekimi yapılır.
Ampisilin aktivitesini kontrol etmek üzere aynı plakta R faktör içermeyen
suşlar da test edilir. 37 oC de 12-24 saatlik bir inkübasyon
sonucu, R faktörü içeren suşlar ampisilinli plaklarda ürerken, R faktörü
içermeyen suşların aynı plaklarda üremediği gözlenir.
c.
Rfa mutasyonunun kontrolü : Test suşlarının gecelik kültürlerinden
alınan 0,1 ml’lik örnekler, nütrient agarlı plaklara ekilip yayılır.
Filtre kağıdından hazırlanmış ve 10 ml kristal viyole çözeltisi
(1mg/ml) emdirilmiş diskler, plağın ortasına yerleştirilir. Plaklar bir
gece 37 oC de inkübe edildikten sonra diskin etrafında inhibisyon
zonu gözlenmektedir. Diskin çevresindeki şefaf bölge, büyük bir molekül
olan kristal viyolenin bakteri içerisine girip, onu öldürmesine izin veren
rfa mutasyonu varlığının göstergesidir.
d. uvrB mutasyonunun kontrolü : Bu mutasyonun varlığı ultraviyole ışınlara duyarlılık testi ile kontrol edilir. Test suşlarının gecelik kültürlerinden öze ile alınan örnekler, nütrient agarlı plaklara tek koloni şeklinde ekilir. 37 oC de bir gecelik inkübasyondan sonra üreyen tek koloniler, steril kürdanlarla alınarak nütrient agarlı iki plağa çizgi testi yöntemiyle ekilir. Bu plaklardan bir tanesi kontrol plağı olarak kullanılır, diğeri ise kapağı açılıp 15 watt’lık germisidal UV. Lambası altında 33 cm uzaklıktan 8 sn. süreyle ışınlanır. Kontrol plağı ve UV’ye maruz bırakılan plak, 37 oC de bir gece inkübe edilir. UvrB delesyonu taşıyan suşların kontrol plağında üreyip, UV ile ışınlanmış plaklarda ise üremediği gözlenir.
e. Kendiliğinden geriye dönen koloni sayısının kontrolü : Test suşlarının, histidinsiz ortamda üreyebilmelerine yol açan kendiliğinden geriye dönüş, mutajenite deneylerinde rutin olarak ölçülüp ve her plakta kendiliğinden geriye dönen bakteri sayısı olarak ifade edilir. Bu bakterilerin kolonileri, oksotrofik bakterilerin oluşturduğu düzenli dağılım gösteren alan üzerinde kolayca gözlenebilir. Her test suşu, kendine özgü bir frekansla kendiliğinden geriye döner. Kendiliğinden geriye dönüş frekanslarını saptayabilmek için minimal glukoz agarlı plaklar hazırlanır. %0,6 Difco agar, % 0,5 NaCl içeren steril 100 ml’lik yumuşak agar 45 oC lik su banyosunda eritilerek üzerine steril 0,5 ml L-histidin HCl/ biotin çözeltisinden 10 ml eklenir ve 2’şer ml olacak şekilde steril tüplere dağıtılır. Bu tüplere her suşun gecelik kültüründen 0,1 ml eklenir ve minimal glukoz agarlı plaklara dökülüp dağılması sağlanır. 37 oC de 48 saatlik inkübasyondan sonra geriye dönen kolonilerin sayımı yapılır. Bu deney her suş için birçok kez tekrarlanır ve ortalama değerler alınır .
1. Test Suşlarının Saklanması :
a) Dondurulmuş örneklerin (frozen permenant) hazırlanması : Genetik özellikleri doğrulanan test suşlarının bu özelliklerini uzun süre kaybetmeden koruyabilmesi için dondurulmuş örnekleri hazırlanır. Bu amaçla, S. thphimurium TA 98 ve TA 100 suşları, sıvı üreme ortamında ml’de 1-2x109 bakteri bulunacak şekilde üretilir. Bakteri kültürlerine, kültürün her ml si için 0,09 ml olacak şekilde (spektrofotometrik saflıkta) dimetilsülfoksit (DMSO) eklenir ve yavaşca karıştırılır. Bu şekilde hazırlanmış kültürler 1-2 ml lik soğuğa dayanıklı plastik tüplere dağıtılır. Tüpler haman kuru buz içerisine yerleştirilerek dondurulup daha sonra –70 oC lik derin dondurucuya kaldırılır. Bu şekilde, S.thphimurium TA 98 ve TA 100 suşları genetik özellikleri bozulmadan 3 yıl saklanabilmektedir
a. Master plakların hazırlanması : Rutin mutajenite çalışmalarında kullanılmak üzere, S. thphimurium TA 98 ve TA 100 suşları için master plakları hazırlanır. Genetik işaretleri doğrulanan suşlar histidin/biotin/ampisilin içeren plaklara ekilir. Bu plaklar +4 oC de iki ay süre ile saklanabilmektedir.
1.
Sitotoksik Etkinin Saptanması : Salmonella/mikrozom test
sisteminde kullanılan test bileşiklerinin, bakteri için öldürücü
olmayan dozlarının saptanabilmesi amacıyla üst agara 0,1 ml uygun derişimde
bakteri kültürü ve en fazla 0,1 ml olacak şekilde değişik miktarlardaki
test bileşiği eklenir. Karışım, nütrient agarlı plaklara dökülerek,
plaklar 37 oC de bir gece inkübe edildikten sonra koloni sayımı
yapılır. Kontrol plağındaki koloni sayısıyla, test bileşikleri ilave
edilmiş plaklardaki koloni sayıları karşılaştırılarak sitotoksik doz
saptanır. Mutajenite deneylerinde, kimyasal bileşiklerin sitotoksik olmayan
dozları kullanılmaktadır.
2.
Test Edilen Kimyasal Bileşiklerin Mutajenik Etkilerinin Saptanması
: Plak inkorporasyon testinde, test bileşiği, bakteriyal test suşu ve
S9 karışımı üst agara karıştırılarak, minimal glukoz agarlı plaklara
dökülür. Plaklar 37 oC de 48-72 saat inkübe edilip, bu süre
sonunda plaklardaki his+ revertant bakteri kolonileri sayılır.Bu yöntemde,
histidin ve biotin eklenmiş 45 oC deki 2 ml lik üst agara, test
suşu kültüründen 0,1 ml, test edilecek kimyasaldan 0,1 ml ve S9 karışımından
0,5 ml eklenip düşük hızda 3 sn vortekslenerek oda sıcaklığındaki
minimal glukoz agarlı plaklara yayılır. Üst agarın plağın bütün yüzeyine
donmadan yayılmasını sağlamak için karıştırma, dökme ve yayma işlemlerinin
tümü 20 saniyeden az bir sürede yapılır. Her deneyde, her suşun geri dönme
özgüllüklerini ve S9 karışımının etkisini doğrulamak için pozitif
mutajenler kullanılarak rutin olarak, pozitif mutajenik etki kontrolleri yapılır.
Bakteriyi, S9 karışımını ve kullanılan çözücüyü içeren, fakat test
edilen kimyasalı içermeyen negatif kontrol plakları, her suş için kendiliğinden
geriye dönen bakteri sayısının saptanmasında kullanılır.
3. Sonuçların Değerlendirilmesi : Salmonella/mikrozom test sisteminde, bir maddeye mutajen denilebilmesi için histidin prototroflarının sayısının kendiliğinden geriye dönen koloni sayısının en az iki katı olması gerekmektedir. Bununla birlikte bu sayı kendiliğinden geriye dönen koloni sayısının iki katından az olup, doza bağlı bir artış söz konusu olursa, bu durumda da bu maddeye mutajen denilebilmektedir.