PCR ( Polymerase Chain Reaction )

Bu teknik Cetus firmasının insan genetiği departmanında çalışan araştırmacı Kary Mullis tarafından 1985’ te bulunmuş ve patenti alınmıştır. PCR; ilk defa, aynı yıl R. Saiki, K. Mullis ve arkadaşları tarafından orak hücre anemisinin tanısının konulmasında uygulamaya sokulmuştur. 1993 yılında bu çalışma Kary Mullis’ e Nobel ödülünü kazandırmıştır.

PCR, herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’ daki özgül bölgelerin çoğaltılmasını ( amplifikasyonunu ) sağlayan basit ama çok başarılı bir invitro DNA sentezi yöntemidir. PCR; DNA molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını kısa zamanda yapan bir tekniktir.PCR;

  1. DNA’ nın dizi analizi ve DNA haritalamasında
  2. Genetik hastalık teşhisinde ( orak hücre anemisi, kistik fibrozis, fragile X sendromu, AIDS, lösemi v.b. )
  3. DNA parmak analizinde
  4. İnsan evrimi araştırmalarında
  5. İnsan Genom Projesi’ ndeki araştırmalarda
  6. Allellik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesinde
  7. Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesi ( analık babalık tayini )
  8. Tarımda ( tohum saflığının belirlenmesi )
  9. Sistematik ve evolüsyon çalışmalarında ( doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesinde )

10)Hatta Mısır’ daki mumyalardan DNA klonlamasında da kullanılmaktadır.

 

 

 

PCR reaksiyonun gereksinimleri deoksinükleotidler, DNA polimeraz primerler, kalıp ve magnezyum içeren PCR tamponudur.

PCR’ ın prensibi; tekrarlanan 3 basamağa dayanır.

  1. Amplifiye edilecek DNA’ nın yüksek sıcaklıkta denatürasyonu (94 C)
  2. Primerlerin DNA’ daki hedef bölgelerle özgül hibridizasyonuna olanak verecek sıcaklıkta annealing reaksiyonu
  3. Primerlerin ayrılmış DNA zincirleri üzerinde komplementer oldukları bölgelere eşleşip kalıp DNA zinciri ile primer arasında hidrojen bağlarının oluşmasının sağlanacağı bir sıcaklık derecesi vardır. Tm ( erime noktası ) adını alan bu sıcaklık derecesi primer dizisinin baz içeriğine göre değişir. Primerdeki G ve C sayısı artıkça Tm derecesi de artar.

    Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) Annealing sıcaklığı genellikle Tm değerinin 5 C aşağısı alınarak belirlenir.

  4. Taq DNA polimeraz enziminin en yüksek aktivite gösterdiği sıcaklık olan 72 C
de primerlerin uzaması, tamamlayıcı zincir sentezi (Extension)

Reaksiyonun özgülüğü çok iyi tanımlanmış primer oligonükleotidlerin seçilmesiyle sağlanır. Bunlar amplifiye edilecek DNA’ ya bağlanacak olan bağlanma bölgesine komplementer yapıda kısa tek sarmal DNA molekülleridir. Primerler çiftler halinde biri çift zincir DNA’ yı oluşturan zincirlerinden birine, diğeri de o zincirin komplementerine eşleşecek şekilde farklı dizilimlerde tasarlanır. Amplifikasyon için DNA dizisinin bilinmesi gerekli değildir. Birleşme bölgelerinin dizisinin bilinmesi yeterlidir.

Reaksiyon için ısıya dayanıklı bir enzim Taq DNA polimeraz Klenow fragmenti kullanılırken günümüzde “Thermus aquaticus” termofilik bakterisinden izole edilen ve ısıya dayanıklı enzim Taq polimeraz kullanılmaktadır. Çünkü bu enzim 94 C de inkübe edildikten sonra bile aktivitesini kaybetmez. Oysa E-coli den elde edilen DNA polimeraz I yüksek sıcaklıkta inaktive olur ve her cycle enzimi yenilemek gerekir. Bu yol hem yavaş hem pahalıdır. O yüzden Taq polimeraz kullanılır.DNA polimeraz enzimleri bir DNA sentezleyebilmek için komplementerini sentezleyeceği bir kalıp DNA molekülüne, substrat olarak dNTP’ lere ve kalıp zincirine eşleşmiş primerin 3 OH grubuna ihtiyaç duyarlar. Enzim bu bileşenlerin bir araya geldiği uygun tampon sisteminde ve uygun sıcaklıkta primerin 3 OH grubuna serbest dNTP’ lerin 5a -fosfat gruplarını 3-5 fosfodiester bağı ile kovalent olarak bağlar.Tamponlar, enzim için gerekli olan elektrolitleri ve koenzimleri sağlar. Yine polimeraz enzimleri aktiviteler için serbest magnezyum iyonlarına gereksinim gösterir.Bu yüzden magnezyum içeren tamponlar kullanılır.

 

PCR için saf DNA kullanılmaya gerek yoktur. Kaba hücre özütü, total DNA preparatı, bir damla kan ya da sperm başarılı bir PCR için başlangıç materyali olabilir.

 

Başlangıçtaki DNA molekülü sayısı PCR’ ın kaç döngü uygulanacağını belirler. 1 – 100 kopya DNA molekülü ile başlanıyorsa 30 – 45 döngü, 1.000 – 100.000 ile başlanıyorsa 20 – 30 döngü yeterlidir. Bir döngü sonucunda başlangıçta n olan DNA zincir sayısı 2n’ e yükselir. Döngüler arka arkaya çok kez tekrarlanırken herbir döngünün ürünü, bir sonrakinde kalıp olarak kullanıldığı için her döngüde istenen DNA segmentinin miktarı 2 katına çıkar.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 Örnek İçin Deneyin Yapılışı

 

DNA 1 – 2 Mg

10 x Buffer 10 Mg

dNTP 0,6 Mg

Primer 1 1 Ml

Primer 2 1Ml

Distile Su 88 Ml

 

 


Toplam 100 Ml

 

Reaksiyon karışımından 85 ml kadar alınıp DNA içeren tüpe eklenir. İyice karıştırılır.

 


PCR aletine konur 94 C
de 4 dakika bekletilir. ( DNA’ nın denatüre olması, muhtemel proteaz kontaminasyonun önlenmesi ve ekzonükleaz aktivitesinin engellenmesi için ) Geriye kalan 15 ml karışıma 2 ml Taq polimeraz eklenir ve DNA içeren tüpe ilave edilir. Gerekirse örneklerin üzeri 2 damla mineral yağ ile örtülür. PCR programı başlatılır. Daha amplifikasyon ürünleri % 1’ lik aganoz jelde kontrol edilir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

KAYNAKÇA

Arı, Şule , 1999 , Ed. Temizkan, Güler; Arda, Nazlı, Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler, “DNA’ nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile Çoğaltılması” ,Nobel Kitabevi, 57-67

 

http://www.accessexcellence.org

 

http://www.biology.ucsa.edu

 

Klug, S.William, Cummings, R.Michael, 1997, Concepts of Genetics, University of Ilinois, Chicago, 515

 

Tamarin, H. Robert,1999, Principles of Genetics, Sixth Ed., Boston, Newyork, Mexico , 341

 

Uygulamalı Moleküler Biyoloji Teknikleri, Lisansüstü Yazokulu, 1997, Eylül, 7-13

 

Hazırlayanlar