“Meloksikamın Farmasötik
Preparatlardan UV Spektrofotometrisive KapilerElektroforezYöntemi ile Analizi”

isimli Yüksek
Lisans tezimden alınmıştır.

II.4. Kapiler Elektroforez
[32,33]

Elektroforez, iletken bir çözelti
içindeki yüklü parçacıkların veya
moleküllerin bir elektriksel alan varlığında
göç etmesidir. Farklı yük ve büyüklükteki
parçacıklar farklı hızlarda göç ederek
birbirlerinden ayrılmaktadırlar. Elektroforetik
yöntemleri aşağıdaki gibi
sınıflandırabiliriz.

1)
Kapiler zon
elektoroforez (CZE)

2)
Miseller elektrokinetik kapiler kromatografi (MEKC)

3)
Kapiler jel elektroforez (CGE)

4)
Kapiler izotakoforez
(CITP)

5)
Kapiler izoelektrik
odaklama (CIEF)

CZE yaygın olarak kullanılan elektroforetik
yöntemlerden biridir ve tez kapsamında bu yöntem ile analizlerin
gerçekleştirilmesine
çalışılmıştır. Bu nedenlerden dolayı
sadece CZE yöntemi incelenecektir.

II.4.1. Kapiler Zon Elektroforez (CZE)

CZE’de
parçacıkların hızlarına elektroforetik
ve elektroosmotik iki kuvvet etki eder.

Katyonlar negatif
yüklü elektrot (Katot)’a doğru, anyonlar pozitif
yüklü elektrot (Anot)’a doğru göç ederler.
Göç hızları yük / büyüklük (yük
/ çap) oranına bağlıdır. Aynı yüklü
iyonlardan küçük olan büyük olanına göre
daha hızlı hareket eder. Büyüklüğü aynı
olanlardan ise yükü daha fazla olan daha hızlı hareket
eder. Bu elektroforetik göçtür.
Ayrıca elektriksel alan altında, kapiler
içinde elektroosmoz ile de hareket söz
konusudur. Bu olay birbirleri ile temasta bulunan iki madde
sınırında elektriksel çift tabaka oluşumundan
kaynaklanır ve sonuçta çözelti elektriksel alanın
etkisi ile elektrotlardan birine doğru göç eder. İki
heterojen madde birbirleri ile temas edince dielektrik
sabiti büyük olan pozitif yüklenir. CZE’de
su içeren tampon sistemi ile kapiler
duvarını oluşturan silikanın teması söz konusu
olduğunda; dielektrik sabiti 80 olan su,
silikaya göre tamponun (+) yüklenmesini sağlar. Elektriksel alan
uygulandığında (+) yüklenmiş olan tampon
çözelti bileşenleri anottan katoda doğru hareket ederek elektroosmotik akışa neden olurlar.

Ayrıca silika kapilerin yüzeyinde bulunan silanol
(Si-OH) grupları 3 ve daha yukarı pH
değerlerinde SiO- ’a dissosiye olurlar. Bu kapilerin NaOH veya KOH ile muamele edilmesi ile sağlanır.
Tampondaki pozitif yüklü iyonlar negatif yüklü SiO- grubuna yaklaşırlar ve kapiler duvarına tutulur ve sabit tabaka
oluştururlar. Bu katyonlar bütün negatif yükleri nötralize etmeye yetecek yoğunlukta
değildirler ve bu yüzden sabit tabakanın üstüne
katyonlardan bir tabaka daha oluşur. Dıştaki katyonlar SiO-’dan daha
uzak oldukları için daha az tutunurlar ve hareketli tabaka
adını alırlar. Bu iki tabaka difüzyon çift
tabakasıdır. Elektriksel alan uygulanınca, katyonların
hareketli olan dış tabakası katoda doğru hareket eder,
böylece tampon çözelti hareket eder ve elektroosmotik
akış oluşur (Şekil II.6).

Sabit ve hareketli tabakalar
arasında kayma alanı bulunmaktadır. Bu alanda iki tabaka
arasında potansiyel farkı oluşur ve bu zeta
potansiyeli (x)
olarak adlandırılır ve Eşitlik II.1’e göre
verilir.

x = 4 p d e / e
(II.1)

d =
Difüzyon tabakası kalınlığı

e = Yüzey alana düşen yük

e =
Tampon dielektrik sabiti

Hareketli Tabaka

Kayma tabakası

Sabit
Tabaka

KATOT

ANOT

Elektroosmotik akış

Kapiler duvar

Şekil II.6.
Kapiler içinde elektroosmotik
akışın gösterimi.

Elektroosmotik
ve elektroforetik etkiler sonucunda CZE’de elüsyon
sırası katyon, nötral ve anyon
şeklinde oluşur. Nötral
bileşikler CZE’de birbirlerinden
ayrılamazlar, ancak
iyonlar yük / büyüklüklerine göre
ayrılırlar (Şekil II.7).

KATOT

ANOT

Şekil II.7.
Kapiler zon elektroforezde ayırım.

Elektroosmotik
akış ters faz polarite uygulanarak tersine çevrilebilir [34].
Bu durumda elüsyon sırası anyonlar, nötraller ve katyonlar şeklinde olur. Ayrıca
elektroosmotik akış çeşitli
yollarla engellenebilir [35]. Bu durumda, sadece katyonlar ayrılabilir. Nötraller enjeksiyon
yapıldığı yerde kalır, anyonlar ise anoda yani
giriş kısmına göç ederler.

CZE’de
ayırım, içi tampon çözelti ile dolu kapiler boruda gerçekleşir. Kapilerin
uçları aynı tampon çözeltiyi içeren
giriş ve çıkış viallerine
daldırılmıştır. Bu tampon çözeltiye
çalışma elektroliti veya çalışma tamponu
denir. Her iki viale daldırılan elektrotlar
ise dış güç kaynağına bağlıdır.
Tampon ile dolu kapilere, numune enjekte edilir ve
voltaj uygulanırsa numune bileşenleri kapiler
içinde zonlar halinde ilerlemeye başlar
(Şekil II.8).

Eelektroosmotik akış

Voltaj uygulaması

KATOT

KATOT

ANOT

ANOT

Şekil II.8.
Kapiler zon elektroforezde numune zonlarının
ayırımı.

CZE çeşitli
tamponlarda çözünen bir çok iyonun
analizinde kullanılabilir. Küçük inorganik anyonlar ve
katyonlar [36,37], büyük biyomoleküller
[38] ve enantiomerler [39] CZE’de
ayrılabilirler. Ayrıca suda çözünmeyen
bileşikler susuz tampon kullanılarak ayrılabilirler [40] .

II.4.1.1. Kapiler Zon
Elektroforezde Ayırım İlkeleri [41]

II.4.1.1.a. Elektroosmotik
akış

Elektroosmotik
akışın sabit olması önemlidir. Eğer
akış değişken olursa maddelerin göç zamanı
değişir bu da yanlış pik tanımlamasına ya da
nicel analizde yanlış miktar bulunmasına neden olabilir.

Elektroosmotik
akış hızı (nEOF) Eşitlik II.2’ye göre
verilir

nEOF = E mEOF
(II.2)

E = Elektriksel alan (volt / cm)

mEOF
=  Elektroosmotik
hareketlilik

Tamponun elektroosmotik
hareketliliği (mEOF)
Eşitlik II.3’te verilmiştir.

mEOF
= e
x
/ 4 p
h
(II.3)

h
= Tampon çözeltisinin viskozitesi

Elektriksel alan (voltaj /
uzunluk) voltaja bağlı olduğundan, elektroosmotik
akış voltajla kolayca kontrol edilebilir (Eşitlik II.2 ). Artan
voltaj ile elektroosmotik akış artar ve
göç zamanı azalır. Ayrıca voltajın artması
yüksek etkinliği de sağlar. Ancak yüksek voltaj ve bunun
sonucu olan yüksek akım kapilerin
ısınmasına da neden olur (Joule
ısınması) (Eşitlik II.4 ).

P = I V
(II.4)

P =
Güç, V = Voltaj, I = Akım

Eğer kapilerdeki
ısınma çabuk soğutulamazsa, sıcaklık kapiler içinde artar ve bu artışta pik
genişlemesine, tekrarlanamayan göç zamanına, numune
bozunması ya da içeriğinin değişmesine veya tampon
kaynamasına yol açarak elektriksel iletkenliğin
önlenmesine neden olabilir. Bu nedenle çalışmalarda dar
pik ve kısa analiz süresi için gerekli olan yükseklikteki
voltaj (maksimum voltaj) seçilmelidir. Maksimum voltaj, voltaja karşı
akım grafiğinden (Ohm yasası
grafiği) tanımlanabilir (Şekil II.9) [42]. Bu grafikte voltaj
yerine elektriksel alan da kullanılabilir. Grafikte doğrusallık
bozulmadan önceki son voltaj, maksimum voltaj değerini verir.
Maksimum voltaj tampon bileşimine, pH’sına
ve derişimine ayrıca kapilerin
iç çapı ve uzunluğuna bağlıdır.

Tampon pH’sı
elektroosmotik akış üzerinde etkili
önemli bir diğer parametredir. pH zeta potansiyelini değiştirmektedir. pH’nın artması ile elektroosmotik
akış artar. Çünkü yüksek pH’da
Si–OH’ın Si–O-’e
iyonizasyonu kapiler
iç duvarında yüksek miktardadır. Bu da zeta potansiyelinin artmasına neden olmaktadır
(Eşitlik II.1). Dolayısıyla pH’nın
yükselmesi (pH 8’e kadar), daha fazla
yüklü Si–O- gruba bu da yüksek zeta potansiyeline ve sonuçta da elektroosmotik
akış hızının artmasına neden olur (Eşitlik
II.2) [43].

VOLTAJ

MAKSİMUM VOLTAJ

AKIM

Şekil II.9.
Voltaja karşı akım (Ohm yasası)
grafiği.

Tampon pH’sı
numunelerin iyonizasyon derecesi üzerinde  ve bundan dolayı elektroforetik hareketliliklerinde de etkilidir. Genellikle
pH en iyi ayrım elde etmek için
seçilir, optimum elektroosmotik
hız için gerekli değildir [44].

Kapiler
sıcaklığı kontrol altında tutulduğunda, tamponun
iyonik kuvveti veya derişimi artırıldığı zaman zeta potansiyelindeki düşüşe
bağlı olarak düşük elektroosmotik
akış elde edilir. Eğer sıcaklık kontrol edilmezse
iyonik gücün ya da derişimin artması, akımın
dolayısıyla da sıcaklığın artmasına neden
olabilir [45]. Artan sıcaklık ise tampon viskozitesinin
azalmasına ve kısa analiz süresi elde edilmesine yol
açar.

Düşük tampon
derişimi kısa analiz süresi verir. Ancak çok
düşük tampon derişiminden
kaçınılmalıdır, çünkü bu durum
geniş ve asimetrik pikler elde edilmesine neden olabilir. Eğer tampon
derişimi numune derişiminden azsa numune ve
tampon arasında hareketliliklerde farklılık vardır. Bu
durum pik genişlemesine ya da pik kuyruklanmasına neden olur [46].
Genel kural olarak çalışma elektrolitinin derişimi numune
derişiminin en az 100 katı
olmalıdır.

Sıcaklıktaki
artış viskozitesinin azalmasına dolayısıyla da elektroosmotik akışın artmasına neden
olur. Suyun sıcaklığı 20 0C’ den 21 0C’ye
artığında viskozitesinde % 2.4’lük
bir azalma olur ve aynı oranda da elektroosmotik
akışta artış beklenir.

Sıcaklık sürekli
kontrol altında tutulmalıdır. Çünkü
sıcaklık, numune bozulmasına, zon genişlemesine,
tampon kaynamasına ve tekrarlanmayan analiz süresine neden olabilir.

Organik
çözücüler viskozite, dielektrik
sabiti ve zeta potansiyel üzerinde etkili
olmaktadırlar [47,48]. Organik fazın etkisi, eklenen organik
fazın cinsine ve miktarına bağlıdır. Suya % 0 –
50 arasında metanolün eklenmesi
çözeltinin viskozitesinin artmasına neden olur. % 50’den
fazla metanol ilavesinde ise viskozite azalır.
Buna karşılık suya % 100’e kadar asetonitril
ilavesinde çözelti viskozitesi azalır ve buna bağlı
olarak analiz süresi de azalır.

Elektroosmotik
akış, çalışılan pH’da
iyonize olmayan, kullanılan dedektörle
tanımlanabilen, saf, kapiler duvarı ile
reaksiyona girmeyen ve çalışma elektroliti içinde
çözülebilen bir bileşik (metanol,
aseton, dimetilsülfoksid gibi) kullanılarak
ölçülebilir [49].

II.4.1.1.b. Elektroforetik hareketlilik

Elektriksel alan altında
tampon içindeki elektriksel yüklü numuneler elektroforetik hızla hareket ederler. Elektroforetik hız (nEP)
Eşitlik II.5’e göre hesaplanır.

nEP
= E mEP
(II.5)

mEP
= Elektroforetik hareketlilik

Elektroforetik
hareketlilik ayrımı gerçekleştirir.
Çünkü elektroforetik hızdan
dolayı numuneler kapiler içinde
değişik hızlarda hareket ederler. Elektroforetik
hareketlilik Eşitlik II.6’ya göre verilir.

mEP
= q / 6 p
h
d
(II.6)

q = İyonize numunenin yükü

d = Numune yarıçapı

Kapiler
içinde küçük ve yüksek yüklü
moleküller hızlı, büyük ve az yüklü
moleküller ise yavaş hareket ederler. Nötral
bileşiklerin yükleri (q) sıfır olduğu için elektroforetik hareketlilikleri sıfırdır.
Tampon viskozitesinin artması elektroosmotik
akışı ve elektroforetik
hareketliliği azaltır.

Numunelerin hızı elektroforetik hıza ve elektroosmotik
akış hızına bağlıdır. Gözlenen elektroforetik hız (na) Eşitlik
II.7’ye göre verilir.

na = nEP + nEOF                                                                                (II.7)

Bu eşitlik kapilerin dedektör
kısmının katoda ve elektroosmotik
akışın giriş vialden
çıkış viale doğru olan
normal kapiler için geçerlidir.
Anyonların gözlenen hızı elektroosmotik
hızdan düşüktür (na Anyon < nEOF).
Çünkü anyonlar elektroosmotik
akışa zıt yönde elektroforetik
hareketliliğe sahiptirler. Katyonlarda ise gözlenen hız elektroosmotik hızdan büyüktür (na
Katyon > nEOF).
Çünkü elektroosmotik
akışla aynı yönde elektroforetik
hareketliliğe sahiptirler. Nötraller ise kapiler içinde yalnızca elektoroosmotik
hızla hareket ederler ve bundan dolayı gözlenen hız elekroosmotik hıza eşittir (na
Nötral = nEOF)
(Şekil II.10).

Gözlenen elektroforetik hız (na) Eşitlik
II 8’e göre hesaplanır.

na = l / tm
(II.8)

l = Etkin kapiler uzunluğu

tm = Göç zamanı

me

ma

ma

me

ma

Anyon

Nötral

Katyon

t

EOF

EOF

EOF

Şekil II.10.

Elektroforetik ve elektroosmotik hızların göç
zamanı üzerine etkisi.      (EOF : Elektroosmotik
akış, me
: Elektroforetik hareketlilik,
ma
: Gözlenen hareketlilik.)

II.4.2. Kapiler Elektroforez Sistemi

Kapiler
elektroforez sistemi; yüksek voltaj
güç kaynağı, giriş ve çıkış vialleri, kapiler, dedektör ve integratör
veya bilgisayardan oluşmaktadır. Bir çok sistemde kapilerdeki ısınmayı soğutmak ve kapiler sıcaklığını kontrol etmek için  termostat
bulunmaktadır (Şekil II.11).

Elektroforez
giriş viali, kapiler
ve çıkış vialin elektrolit ile
doldurulması ile gerçekleşir. Kapilerin
giriş kısmına numune viali
yerleştirilir ve numune kapiler içine
enjekte edildikten sonra kapilerin giriş
kısmı tekrar giriş vialine
daldırılır. Giriş ve çıkış viali arasına voltaj uygulanır. Numuneler kapiler içinde göç ederler, dedektörden geçerken gözlemlenirler ve
veriler integratör veya bilgisayara
gönderilir. Veriler, dedektör
cevabının zamana karşı grafiği olan elektroferogramlar şeklinde elde edilir.

Katot

Anot

Çıkış Viali

Dedektör

Kapiler

Elektrolit

Çözeltisi

Giriş Viali

İNTEGRATÖR

VEYA

BİLGİSAYAR

Kapiler Termostatd

Bölümü

Yüksek

Voltaj Güç Kaynağı

Şekil II.11.
Kapiler elektroforez
cihazının bölümleri.

II.4.2.1. Numune Enjeksiyonu

Teknik olarak numune kapilere enjekte edilmez giriş yapılır. Buna
karşılık enjeksiyon terimi çok
genel olarak kullanılmakta ve analizi yapılacak maddenin kapilere enjeksiyonu a) hidrodinamik (hidrostatik) veya b) elektrokinetik (elektrogöç)
olarak yapılmaktadır.

Enjekte edilen numune hacmi
genellikle bilinmeyen miktardadır fakat enjekte edilen miktarlar
yöntemlere göre hesaplanabilir. Ama yine de hacim yerine hidrodinamik
enjeksiyonda basınç / süre, elektrokinetik
enjeksiyon için voltaj / süre
kullanılabilir.

A) Hidrodinamik Enjeksiyon:

Hidrodinamik enjeksiyon
en geniş kullanılan enjeksiyon yöntemidir. Giriş vialin yerine numune viali
alındıktan sonra numune vialine
basınç veya çıkış viale
vakum uygulanarak veya sifonla enjeksiyon
yapılabilir (Şekil II.12.a,b,c).

Basınçla
yapılan enjeksiyonda numune hacmi Hagen – Poiseuille
eşitliğine göre hesaplanabilir (Eşitlik II.9) [50].

V i =
DP
r4 p
t / 128 h
L                                                       (II.9)

V i =
Enjekte edilen numune hacmi

DP = Kapiler uçları arasındaki
basınç farkı

r = Kapiler
yarıçapı

t = Enjeksiyon süresi

L = Toplam
kapiler uzunluğu

c

b

Basınç

d

Sifon

Vakum

a

Şekil II.12. Kapiler elektroforezde enjeksiyon sistemleri a, b, c) Hidrodinamik

enjeksiyon ve d) Elektrokinetik
enjeksiyon.

B) Elektrokinetik enjeksiyon

Elektrokinetik
enjeksiyonda numune anoda yerleştirildikten sonra
belli bir süre voltaj uygulanarak örnek kapiler
içine çekilir (Şekil II.12.d). Daha sonra anot giriş vialine daldırılır ve elektroforez
uygulanır. Enjekte edilen miktar Eşitlik II.10’e göre
hesaplanır.

Qinj = V p C t
r2 (mEP
+ mEOF)
/ L
(II.10)

Qinj = Enjekte edilen miktar

C = Numune
derişimi

t = Voltaj uygulama süresi

II.4.2.2 Kapiler

İdeal kapiler
materyali; elektriksel ve kimyasal olarak inert
olmalı, ultraviyole / görünür
bölge (UV/GB) geçirgen olmalı ve pahalı
olmamalıdır.

Eritilmiş silika
günümüzde en çok kullanılan materyaldir. Pyreks kapiler, eritilmiş
silika kapilere göre daha sağlam
olması ve dedektör penceresi açmaya
ihtiyaç göstermemesine rağmen 280 nm’nin
altında çalışılamama dezavantajına sahiptir.
Teflon kapilerde homojen iç çap elde
edilemez ve ısı iletim özelliğinin düşük
olmasından dolayı yüksek voltaj uygulanamaz. Bu sebeplerden
dolayı eritilmiş silika, pyreks ve teflona
göre daha fazla kullanılan kapiler
materyalidir.

Eritilmiş silika kapilerlerin iç çapı 25 – 100 mm
aralığında olanlar en fazla kullanılmaktadır.
Büyük çaplı kapilerde
yüksek ısı açığa çıkar ve kapilerin iç duvarıyla merkezi arasındaki
ısı farkı çok büyük olur.
Küçük çaplı kapiler
kullanılması ile UV/GB absorbans veya floresans gibi dedektörlerde
ışık yolunun küçülmesinden dolayı absorbans düşer ve pik yüksekliği
azalır.

Kapiler
elektroforezde tekrarlanabilirlik elde etmek
için en önemli parametre kapilerin
şartlandırılmasıdır. Silika yüzeyinin durumu elektroosmotık akış üzerinde etkilidir.
Dolayısıyla silanol gruplarının protonizasyon oranı ya da yüzeyine madde absorpsiyonu elektroosmotık
akış değişmesine neden olur. Bu etkiyi ortadan
kaldırmak için kapilerin
şartlandırılması gerekmektedir [51]. Kapiler
yeni ise 1 N NaOH  takiben 0.1 N NaOH, su ve en son olarakta
çalışma elektroliti ile yıkanarak
şartlandırılır. Ayrıca her analizden önce 0.1 N NaOH, su ve
çalışma elektroliti ile kapiler
yıkanarak kapilerin mümkün
olduğunca aynı şartlanması sağlanır.
Çalışma bitiminde su ile yıkama
yapılmalıdır. Eğer birkaç gün
çalışma yapılmayacaksa kapiler
içinde mikroorganizma üreyeceği göz önüne
alınarak kapilere hava çekilerek
bırakılması yararlı olur. Ayrıca kapiler
kuvvetli asit veya organik çözücüler ile de
yıkanarak şartlandırılabilir [52].

II.4.2.3. Kapiler Termostat

Kapiler
elektroforezde kapiler
sıcaklığının kontrolü önemlidir.
Sıcaklığın değişmesi etkinlik, göç
zamanı, enjeksiyon hacmi ve dedektör
cevabı üzerinde etkilidir. Ayrıca numune bozunmasına da
neden olabilir. Kapiler
sıcaklığının değişmemesi termostat
kontrolü ile sağlanır.

II.4.2.4. Dedektör

Kapiler
elektroforezde UV/GB absorbans,
floresans, kütle spektrometrisi,
iletkenlik, amperometrik, radyometrik ve
kırılma indisi dedektörleri
kullanılmaktadır.

UV/GB absorpsiyon
için dizi diyot dedektör
kullanımı, pikin saflığı hakkında bilgi verir. Bu
amaçla pikin çıkan, tepe ve inen kısımlarında
olmak üzere alınan üç spektrum birbirleriyle
çakıştırılarak pik saflık indisi bulunur. Bu
indis değeri 1 ve1’e yakın ise pikin tek bileşenden
oluştuğu anlaşılır.

II.4.2.5. Güç Kaynağı

Kapiler
üzerinde elektriksel alan elde etmek için kullanılır.
Sabit voltaj, sabit akım veya sabit güçle kontrol edilir.
Voltaj 30 kV’a kadar, akım 300 mA’e kadar ve güç 6 W’a
kadar uygulanabilir. Ayrıca gerektiği durumlarda ters faz polarite
(giriş viale katot, çıkış viale anot) uygulayabilir.

II.4.3. Elektroforetik
Parametrelerin Ayırım Parametreleri Üzerine Etkisi

Elektroforetik
ayırım parametreleri zaman, etkinlik, seçicilik ve
ayırıcılıktır.

II.4.3.1. Zaman

Numunelerin etkin kapiler uzunluğundaki göç zamanı (tm) Eşitlik II.11’e göre
hesaplanır.

tm = l L / (mEP
+ mEOF)
V
(II.11)

Eşitlik II.11’den
görüldüğü gibi, yüksek voltaj, kısa kapiler ve yüksek elektroosmotik
akış ile kısa analiz süresi elde edilir.

II.4.3.2 Etkinlik

Etkinlik teorik tabaka
sayısı (N) ile belirlenir. Teorik tabaka sayısı
göç zamanı ve pik genişliğinin
ölçülmesiyle hesaplanabilir (Eşitlik II.12).

N = 16 (tm / w)2
(II.12)

w = Pik genişliği

Eşitlik II.12’e
göre dar pik genişliği ve uzun analiz süresiyle yüksek
etkinlik elde edilir.

II.4.3.3. Seçicilik

Seçicilik (a)
komşu iki pikin dedektörden geçerken
birbirlerine olan uzaklıklarını gösterir (Eşitlik
II.13).

a = (t2 - t0)
/ (t1 - t0)                                                           (II.13)

t1
= Göç zamanı kısa olanın göç zamanı

t2
= Göç zamanı uzun olanın göç zamanı

t0
= Sadece elektroosmotik akış ile
sürüklenen maddenin göç zamanı.

Çalışma
elektrolitinin pH’sındaki
değişim ve organik çözücüler
seçiciliği etkiler.

II.4.3.4. Ayırıcılık

En önemli
ayırım parametresi olan ayırıcılık (R), elektroferogramlardan hesaplanabilir (Eşitlik II.14).

R = 2 (t2
– t1) / (w1 + w2)                                                              (II.14)

w1
ve w2 = Komşu piklerin pik genişliği

Ayırıcılık,
uygulanan voltajı artırarak, elektrolit çözeltisinin pH’sını ve bileşimini
değiştirerek, kapiler uzunluğunu
artırılarak ve elektroosmotik
akış optimize edilerek artırılabilir.